随着人們對免疫治療興趣的增長(cháng)，對更好的CAR-T細胞制造工(gōng)具(jù)的需求也在增長(cháng)。CRISPR技(jì )術的進步能(néng)解決這個問題嗎？
在過去的十年裏，一種新(xīn)的免疫治療工(gōng)具(jù)進入了臨床。被設計成表達嵌合抗原受體(tǐ)的T細胞，即CAR-T細胞，已經被證明可(kě)以幫助血癌患者。2011年的一項關鍵研究使用(yòng)第二代CAR-T細胞來實現大多(duō)數測試患者T細胞的持續激活和緩解。
一年後出現了另一個重大突破，兩個小(xiǎo)組描述了一種名(míng)為(wèi)CRISPR-Cas9的新(xīn)型基因編輯工(gōng)具(jù)，并演示了它在真核細胞中(zhōng)的應用(yòng)。這兩份報告幫助開啓了基因編輯的新(xīn)時代。
盡管基因編輯有(yǒu)可(kě)能(néng)改善細胞工(gōng)程，但CAR-T細胞和CRISPR的交叉還需要幾年時間。
圖片來源：https://cn.bing.com
尋找方法
從一開始，CAR - T細胞就顯示出了巨大的殺癌潛力，但制造這些細胞既繁瑣又(yòu)複雜。
為(wèi)了推進CAR-T細胞治療，研究人員需要找到一種更有(yǒu)效的方法來設計長(cháng)CAR序列。
CRISPR驅動CAR的發展
從一開始，CRISPR就像是制造T細胞的理(lǐ)想方法。這是一個簡單的過程，具(jù)有(yǒu)最小(xiǎo)的脫靶效應，适用(yòng)于多(duō)種細胞類型。但CRISPR在一個領域遇到了困難。
CRISPR-Cas9通過産(chǎn)生靶向雙鏈DNA (dsDNA)斷裂，然後通過細胞的非同源末端連接途徑修複，從而有(yǒu)效地産(chǎn)生小(xiǎo)的突變。然而，當使用(yòng)同源導向的修複機制插入外源DNA時，CRISPR編輯的效率可(kě)能(néng)低得可(kě)憐。然而，插入DNA對于制造CAR-T細胞至關重要。
位于奧馬哈的内布拉斯加大學(xué)醫(yī)學(xué)中(zhōng)心(University of Nebraska Medical Center)的基因工(gōng)程師Channabasavaiah Gurumurthy表示："Easi-CRISPR是一種更好的工(gōng)具(jù)，适用(yòng)于同源性導向修複。"
Gurumurthy和他(tā)的合作(zuò)者發現，當使用(yòng)CRISPR将DNA插入細胞時，長(cháng)單鏈DNA (ssDNA)是比雙鏈DNA更有(yǒu)效的模闆。使用(yòng)Easi-CRISPR，長(cháng)ssDNA與含有(yǒu)Cas9和導向RNA的預組裝(zhuāng)複合物(wù)一起被注入，導緻更高的靶标編輯率和更低的脫靶編輯率。之前的報道顯示，化學(xué)合成的具(jù)有(yǒu)2-甲氧基和硫代磷酸基團修飾的單導向RNA (sgRNA)增強了原代細胞的細胞内穩定性和編輯效率。此後，CRISPR-Cas9似乎開始成為(wèi)T細胞内産(chǎn)生缺失和插入的有(yǒu)效工(gōng)具(jù)。
去年，Alexander Marson、Gurumurthy和他(tā)的同事們利用(yòng)Easi-CRISPR對人類T細胞的結構和功能(néng)進行了重新(xīn)編程，且不需要病毒載體(tǐ)。本研究表明，将ssDNA作(zuò)為(wèi)同源性導向的修複模闆對T細胞進行CRISPR編輯，與dsDNA模闆相比，能(néng)夠更準确、更有(yǒu)效地進行大規模的基因插入，并且脫靶整合概率更低。
圖片來源：https://cn.bing.com
展望未來
雖然有(yǒu)希望，但還有(yǒu)一個重要的考慮。"長(cháng)ssDNA序列很(hěn)難在實驗室中(zhōng)産(chǎn)生，尤其是在基因編輯實驗中(zhōng)需要高濃度的長(cháng)ssDNA，" Marson實驗室的成員、該研究的第一作(zuò)者Theodore Roth說。
一些公(gōng)司和研究開發人員正試圖解決這個問題，他(tā)們正在研究有(yǒu)效生成大量長(cháng)ssDNA的方法。總部位于新(xīn)澤西州皮斯卡塔韋(Piscataway)的全球生物(wù)技(jì )術公(gōng)司GenScript以其領先的DNA合成技(jì )術而聞名(míng)。該公(gōng)司最近開始提供數千個核苷酸長(cháng)度的ssDNA，數量可(kě)達100微克--這是使用(yòng)CRISPR進行T細胞重編程的理(lǐ)想選擇。GenScript也是為(wèi)數不多(duō)的提供完整的CRISPR解決方案的公(gōng)司之一，包括HPLC純化的、化學(xué)合成的sgRNAs，并通過末端修飾來增強CRISPR編輯。
基因編輯正在改變研究人員研究細胞工(gōng)程的方式。像Easi-CRISPR這樣的方法，連同DNA和RNA合成的改進，将進一步加強CAR-T細胞工(gōng)程的努力，最終改善癌症治療和人類健康。（生物(wù)谷Bioon.com）
參考資料：
【1】
【2】Porter， D.L.， et al. N Engl J Med 365， 725-733 (2011). DOI： 10.1056/NEJMoa1103849
【3】Jinek， M.， et al.. Science 3337， 816-812 (2012). DOI： 10.1126/science.1225829
【4】Cong， L.， et al. . Science 339， 819-823 (2013). DOI： 10.1126/science.1231143
【5】Miura， H.， et al. . Nat Protoc. 13， 195-215 (2018). DOIhttps：//doi.org/10.1038/nprot.2017.153
【6】Hendel， A. et al. . Nat. Biotechnol. 33， 985-989 (2015). DOIhttps：//doi.org/10.1038/nbt.3290
【7】Roth， T.L.， et al. . Nature 559， 405-409 (2018). DOI https：//doi.org/10.1038/s41586-018-0326-5